nyheter

Under det senaste decenniet har gensekvenseringsteknik använts i stor utsträckning inom cancerforskning och klinisk praxis och blivit ett viktigt verktyg för att avslöja cancers molekylära egenskaper. Framsteg inom molekylär diagnos och riktad terapi har främjat utvecklingen av koncept för precisionsterapi inom tumörer och medfört stora förändringar inom hela området tumördiagnos och behandling. Genetiska tester kan användas för att varna för cancerrisk, vägleda behandlingsbeslut och utvärdera prognos, och är ett viktigt verktyg för att förbättra patienters kliniska resultat. Här sammanfattar vi de senaste artiklarna som publicerats i CA Cancer J Clin, JCO, Ann Oncol och andra tidskrifter för att granska tillämpningen av genetiska tester vid cancerdiagnos och behandling.

Somatiska mutationer och mutationer i könslinjerna. I allmänhet orsakas cancer av DNA-mutationer som kan ärvas från föräldrar (mutationer i könslinjerna) eller förvärvas med åldern (somatiska mutationer). Mutationer i könslinjerna förekommer från födseln, och mutatorn bär vanligtvis mutationen i DNA:t i varje cell i kroppen och kan föras vidare till avkomman. Somatiska mutationer förvärvas av individer i icke-gametiska celler och förs vanligtvis inte vidare till avkomman. Både mutationer i könslinjerna och somatiska mutationer kan förstöra cellernas normala funktionella aktivitet och leda till malign transformation av celler. Somatiska mutationer är en viktig drivkraft för malignitet och den mest prediktiva biomarkören inom onkologi. Emellertid bär cirka 10 till 20 procent av tumörpatienter på mutationer i könslinjerna som avsevärt ökar deras cancerrisk, och vissa av dessa mutationer är också terapeutiska.
Drivmutation och passagerarmutation. Inte alla DNA-varianter påverkar cellfunktionen; i genomsnitt krävs det fem till tio genomiska händelser, så kallade "drivarmutationer", för att utlösa normal celldegeneration. Drivmutationer förekommer ofta i gener som är nära besläktade med celllivsaktiviteter, såsom gener involverade i celltillväxtreglering, DNA-reparation, cellcykelkontroll och andra livsprocesser, och har potential att användas som terapeutiska mål. Det totala antalet mutationer i alla cancerformer är dock ganska stort, från några tusen i vissa bröstcancerformer till mer än 100 000 i vissa mycket variabla kolorektala och endometriecancerformer. De flesta mutationer har ingen eller begränsad biologisk betydelse, även om mutationen inträffar i den kodande regionen, kallas sådana obetydliga mutationshändelser "passagerarmutationer". Om en genvariant i en viss tumörtyp förutsäger dess svar på eller resistens mot behandling, anses varianten vara kliniskt operabel.
Onkogener och tumörsuppressorgener. Gener som ofta muteras i cancer kan grovt delas in i två kategorier, onkogener och tumörsuppressorgener. I normala celler spelar proteinet som kodas av onkogener huvudsakligen rollen för att främja cellproliferation och hämma cellapoptos, medan proteinet som kodas av onkosuppressorgener huvudsakligen ansvarar för att negativt reglera celldelning för att upprätthålla normal cellfunktion. I den maligna transformationsprocessen leder genommutation till ökad onkogenaktivitet och minskning eller förlust av onkosuppressorgenaktivitet.
Liten variation och strukturell variation. Dessa är de två huvudtyperna av mutationer i genomet. Små varianter förändrar DNA genom att ändra, ta bort eller lägga till ett litet antal baser, inklusive basinsättning, deletion, läsramsskifte, startkodonförlust, stoppkodonförlustmutationer, etc. Strukturell variation är en stor omorganisering av genomet, som involverar gensegment som varierar i storlek från några tusen baser till majoriteten av kromosomen, inklusive förändringar i genkopienummer, kromosomdeletion, duplicering, inversion eller translokation. Dessa mutationer kan orsaka en minskning eller förbättring av proteinfunktionen. Förutom förändringar på nivån av enskilda gener är genomiska signaturer också en del av kliniska sekvenseringsrapporter. Genomiska signaturer kan ses som komplexa mönster av små och/eller strukturella variationer, inklusive tumörmutationsbelastning (TMB), mikrosatellitinstabilitet (MSI) och homologa rekombinationsdefekter.

Klonal mutation och subklonal mutation. Klonala mutationer finns i alla tumörceller, är närvarande vid diagnos och förblir närvarande även efter att behandlingen fortskrider. Därför har klonala mutationer potential att användas som terapeutiska mål för tumörer. Subklonala mutationer finns endast i en delmängd av cancerceller och kan detekteras i början av diagnosen, men försvinner vid efterföljande återfall eller uppträder först efter behandling. Cancerheterogenitet avser förekomsten av flera subklonala mutationer i en enda cancer. Det är värt att notera att den stora majoriteten av kliniskt signifikanta drivmutationer i alla vanliga cancerarter är klonala mutationer och förblir stabila under hela cancerprogressionen. Resistens, som ofta medieras av subkloner, kanske inte detekteras vid diagnostillfället men uppträder när den återfaller efter behandling.

Den traditionella tekniken FISH eller cellkaryotypning används för att detektera förändringar på kromosomnivå. FISH kan användas för att detektera genfusioner, deletioner och amplifieringar, och anses vara "guldstandarden" för att detektera sådana varianter, med hög noggrannhet och känslighet men begränsad genomströmning. Vid vissa hematologiska maligniteter, särskilt akut leukemi, används karyotypning fortfarande för att vägleda diagnos och prognos, men denna teknik ersätts gradvis av riktade molekylära analyser som FISH, WGS och NGS.
Förändringar i enskilda gener kan detekteras med PCR, både realtids-PCR och digital dropp-PCR. Dessa tekniker har hög känslighet, är särskilt lämpliga för detektion och övervakning av små kvarvarande lesioner och kan ge resultat på relativt kort tid. Nackdelen är att detektionsområdet är begränsat (vanligtvis detekteras endast mutationer i en eller ett fåtal gener), och möjligheten att göra flera tester är begränsad.
Immunohistokemi (IHC) är ett proteinbaserat övervakningsverktyg som vanligtvis används för att detektera uttrycket av biomarkörer som ERBB2 (HER2) och östrogenreceptorer. IHC kan också användas för att detektera specifika muterade proteiner (såsom BRAF V600E) och specifika genfusioner (såsom ALK-fusioner). Fördelen med IHC är att det enkelt kan integreras i den rutinmässiga vävnadsanalysprocessen, så det kan kombineras med andra tester. Dessutom kan IHC ge information om subcellulär proteinlokalisering. Nackdelarna är begränsad skalbarhet och höga organisatoriska krav.
Andra generationens sekvensering (NGS) NGS använder parallella sekvenseringstekniker med hög genomströmning för att detektera variationer på DNA- och/eller RNA-nivå. Denna teknik kan användas för att sekvensera både hela genomet (WGS) och genregionerna av intresse. WGS ger den mest omfattande informationen om genomiska mutationer, men det finns många hinder för dess kliniska tillämpning, inklusive behovet av färska tumörvävnadsprover (WGS är ännu inte lämpligt för analys av formalinimmobiliserade prover) och den höga kostnaden.
Riktad NGS-sekvensering inkluderar hel exonsekvensering och målgenpaneler. Dessa tester berikar intressanta regioner med DNA-prober eller PCR-amplifiering, vilket begränsar mängden sekvensering som krävs (hela exomet utgör 1 till 2 procent av genomet, och även stora paneler som innehåller 500 gener utgör endast 0,1 procent av genomet). Även om hel exonsekvensering fungerar bra i formalinfixerade vävnader, är kostnaden fortfarande hög. Målgenkombinationer är relativt ekonomiska och möjliggör flexibilitet i valet av gener som ska testas. Dessutom framträder cirkulerande fritt DNA (cfDNA) som ett nytt alternativ för genomisk analys av cancerpatienter, så kallade flytande biopsier. Både cancerceller och normala celler kan frigöra DNA i blodomloppet, och det DNA som utsöndras från cancerceller kallas cirkulerande tumör-DNA (ctDNA), vilket kan analyseras för att detektera potentiella mutationer i tumörceller.
Valet av test beror på det specifika kliniska problemet som ska åtgärdas. De flesta biomarkörer som är associerade med godkända behandlingar kan detekteras med FISH-, IHC- och PCR-tekniker. Dessa metoder är rimliga för detektion av små mängder biomarkörer, men de förbättrar inte detektionseffektiviteten med ökande genomströmning, och om för många biomarkörer detekteras kan det finnas otillräcklig vävnad för detektion. Vid vissa specifika cancerformer, såsom lungcancer, där vävnadsprover är svåra att erhålla och det finns flera biomarkörer att testa för, är användning av NGS ett bättre val. Sammanfattningsvis beror valet av analys på antalet biomarkörer som ska testas för varje patient och antalet patienter som ska testas för biomarkören. I vissa fall är användningen av IHC/FISH tillräcklig, särskilt när målet har identifierats, såsom detektion av östrogenreceptorer, progesteronreceptorer och ERBB2 hos bröstcancerpatienter. Om en mer omfattande utforskning av genommutationer och sökandet efter potentiella terapeutiska mål krävs, är NGS mer organiserat och kostnadseffektivt. Dessutom kan NGS övervägas i fall där IHC/FISH-resultaten är tvetydiga eller ofullständiga.

Olika riktlinjer ger vägledning om vilka patienter som bör vara berättigade till genetisk testning. År 2020 utfärdade ESMO Precision Medicine Working Group de första rekommendationerna för NGS-testning för patienter med avancerad cancer, och rekommenderade rutinmässig NGS-testning för avancerad icke-skivepitelcancer av icke-småcellig lungcancer, prostatacancer, kolorektal cancer, gallgångscancer och tumörprover från äggstockscancer, och år 2024 uppdaterade ESMO på denna grund och rekommenderade inkludering av bröstcancer och sällsynta tumörer, såsom gastrointestinala stromala tumörer, sarkom, sköldkörtelcancer och cancer av okänt ursprung.
År 2022 angav ASCO:s kliniska yttrande om somatisk genomtestning hos patienter med metastatisk eller avancerad cancer att om en biomarkörrelaterad behandling godkänns för patienter med metastatiska eller avancerade solida tumörer, rekommenderas genetisk testning för dessa patienter. Till exempel bör genomtestning utföras på patienter med metastatiskt melanom för att screena för BRAF V600E-mutationer, eftersom RAF- och MEK-hämmare är godkända för denna indikation. Dessutom bör genetisk testning också utföras om det finns en tydlig markör för resistens för läkemedlet som ska administreras till patienten. Egfrmab är till exempel ineffektivt vid KRAS-muterad kolorektal cancer. Vid bedömning av en patients lämplighet för gensekvensering bör patientens fysiska status, komorbiditeter och tumörstadium integreras, eftersom den serie steg som krävs för genomsekvensering, inklusive patientens samtycke, laboratoriebearbetning och analys av sekvenseringsresultat, kräver att patienten har tillräcklig fysisk kapacitet och förväntad livslängd.
Förutom somatiska mutationer bör även vissa cancerformer testas för könslinjegener. Testning för könslinjemutationer kan påverka behandlingsbeslut för cancerformer som BRCA1- och BRCA2-mutationer i bröst-, äggstocks-, prostata- och bukspottkörtelcancer. Könslinjemutationer kan också ha implikationer för framtida cancerscreening och prevention hos patienter. Patienter som potentiellt är lämpliga för testning för könslinjemutationer måste uppfylla vissa villkor, vilka involverar faktorer som familjehistoria av cancer, ålder vid diagnos och typ av cancer. Många patienter (upp till 50 %) som bär på patogena mutationer i könslinjen uppfyller dock inte traditionella kriterier för testning för könslinjemutationer baserat på familjehistoria. För att maximera identifieringen av mutationsbärare rekommenderar därför National Comprehensive Cancer Network (NCCN) att alla eller de flesta patienter med bröst-, äggstocks-, endometrie-, bukspottkörtel-, kolorektal- eller prostatacancer testas för könslinjemutationer.
När det gäller tidpunkten för genetisk testning, eftersom den stora majoriteten av kliniskt signifikanta drivmutationer är klonala och relativt stabila över cancerprogressionen, är det rimligt att utföra genetisk testning på patienter vid tidpunkten för diagnos av avancerad cancer. För efterföljande genetisk testning, särskilt efter molekylär riktad behandling, är ctDNA-testning mer fördelaktigt än tumörvävnads-DNA, eftersom blod-DNA kan innehålla DNA från alla tumörlesioner, vilket är mer gynnsamt för att få information om tumörheterogenitet.
Analys av ctDNA efter behandling kan möjligen förutsäga tumörrespons på behandling och identifiera sjukdomsprogression tidigare än standardavbildningsmetoder. Protokoll för att använda dessa data för att vägleda behandlingsbeslut har dock inte fastställts, och ctDNA-analys rekommenderas inte såvida det inte är i kliniska prövningar. ctDNA kan också användas för att bedöma små kvarvarande lesioner efter radikal tumörkirurgi. ctDNA-testning efter operation är en stark prediktor för efterföljande sjukdomsprogression och kan hjälpa till att avgöra om en patient kommer att dra nytta av adjuvant kemoterapi, men det rekommenderas fortfarande inte att använda ctDNA utanför kliniska prövningar för att vägleda beslut om adjuvant kemoterapi.

Databehandling Det första steget i genomsekvensering är att extrahera DNA från patientprover, förbereda bibliotek och generera rådata för sekvensering. Rådata kräver ytterligare bearbetning, inklusive filtrering av data av låg kvalitet, jämförelse med referensgenomet, identifiering av olika typer av mutationer genom olika analytiska algoritmer, bestämning av effekten av dessa mutationer på proteintranslation och filtrering av mutationer i könslinjer.
Annotering av drivrutinsgen är utformad för att skilja mellan förar- och passagerarmutationer. Drivrutinsmutationer leder till förlust eller förstärkning av tumörsuppressorgenaktivitet. Små varianter som leder till inaktivering av tumörsuppressorgener inkluderar nonsensmutationer, frameshift-mutationer och nyckelmutationer vid splitsningsställen, såväl som mindre frekventa startkodondeletioner, stoppkodondeletioner och ett brett spektrum av introninsättnings-/deletionsmutationer. Dessutom kan missense-mutationer och små introninsättnings-/deletionsmutationer också leda till förlust av tumörsuppressorgenaktivitet när de påverkar viktiga funktionella domäner. Strukturella varianter som leder till förlust av tumörsuppressorgenaktivitet inkluderar partiell eller fullständig gendeletion och andra genomiska varianter som leder till förstörelse av genens läsram. Små varianter som leder till förbättrad funktion av onkogener inkluderar missense-mutationer och enstaka introninsättningar/deletioner som riktar sig mot viktiga proteinfunktionella domäner. I sällsynta fall kan proteintrunkering eller mutationer vid splitsningsställen leda till aktivering av onkogener. Strukturella variationer som leder till onkogenaktivering inkluderar genfusion, gendeletion och genduplicering.
Klinisk tolkning av genomisk variation bedömer den kliniska betydelsen av identifierade mutationer, dvs. deras potentiella diagnostiska, prognostiska eller terapeutiska värde. Det finns flera evidensbaserade graderingssystem som kan användas för att vägleda den kliniska tolkningen av genomisk variation.
Memorial Sloan-Kettering Cancer Centers Precision Medicine Oncology Database (OncoKB) klassificerar genvarianter i fyra nivåer baserat på deras prediktiva värde för läkemedelsanvändning: Nivå 1/2, FDA-godkända, eller kliniskt standardiserade biomarkörer som förutsäger svaret på en specifik indikation på ett godkänt läkemedel; Nivå 3, FDA-godkända eller icke-godkända biomarkörer som förutsäger svar på nya riktade läkemedel som har visat lovande resultat i kliniska prövningar, och Nivå 4, icke-FDA-godkända biomarkörer som förutsäger svar på nya riktade läkemedel som har visat övertygande biologiska bevis i kliniska prövningar. En femte undergrupp associerad med behandlingsresistens lades till.
Riktlinjerna för tolkning av somatisk variation från American Society for Molecular Pathology (AMP)/American Society of Clinical Oncology (ASCO)/College of American Pathologists (CAP) delar in somatisk variation i fyra kategorier: Grad I, med stark klinisk betydelse; Grad II, med potentiell klinisk betydelse; Grad III, okänd klinisk betydelse; Grad IV, ingen känd klinisk betydelse. Endast varianter av grad I och II är värdefulla för behandlingsbeslut.
ESMOs Molecular Target Clinical Operability Scale (ESCAT) klassificerar genvarianter i sex nivåer: Nivå I, måltavlor lämpliga för rutinmässig användning; Fas II, ett måltavla som fortfarande studeras, kommer sannolikt att användas för att screena den patientpopulation som skulle kunna dra nytta av målläkemedlet, men mer data behövs för att stödja detta. Grad III, riktade genvarianter som har visat klinisk nytta hos andra cancerarter; Grad IV, endast riktade genvarianter som stöds av prekliniska bevis; I grad V finns det bevis som stöder den kliniska betydelsen av att rikta in sig på mutationen, men behandling med en enda läkemedelsbehandling mot målet förlänger inte överlevnaden, eller så kan en kombinationsbehandlingsstrategi antas; Grad X, brist på kliniskt värde.